Слайд 2
Реакции антиген-антитело
- основа диагностических реакций.
Фазы реакции:
специфическая фаза -
быстрое специфическое связывание активного центра антитела с детерминантой антигена.
неспецифическая фаза - более медленная, проявляется видимыми физическими явлениями (образование хлопьев, помутнения); требует наличия определенных условий (электролитов, оптимального рН среды).
Прочность и количество связавшегося антигена зависят от
свойств антител:
аффинности,
валентности,
авидности.
Слайд 3
Серологические методы
(от лат. serum — сыворотка и
logos — учение)
– методы изучения антител и антигенов
с помощью реакций антиген-антитело, определяемых в сыворотке крови и других жидкостях, а также тканях организма.
ЦЕЛИ:
постановка диагноза (обнаружение в сыворотке больного антител против антигенов возбудителя);
идентификация антигенов микробов, биологически активных веществ, групп крови, тканевых и опухолевых антигенов, иммунных комплексов, рецепторов клеток и др.(с помощью диагностических сывороток).
Слайд 4
Виды серологических реакций:
агглютинации,
преципитации,
нейтрализации,
р-ии с участием
комплемента,
р-ии с использованием меченых антител и антигенов (радиоиммунологический,
иммуноферментный, иммунофлюоресцентный методы).
Различаются
по регистрируемому эффекту,
технике постановки.
Характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью.
Слайд 5
Реакция агглютинации
(от лат. agglutinatio - склеивание)
реакция
связывания антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток,
нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, макромолекулярных агрегатов).
Протекает при наличии электролита (изотонического раствора NaCl)
Проявляется образованием хлопьев или осадка.
Применение:
1) определение антител в сыворотке крови больных (при бруцеллезе - реакции Райта, Хеддельсона, при брюшном тифе и паратифах -реакция Видаля и т.д.);
2) определения возбудителя, выделенного от больного;
3) определения групп крови с исп-ем моноклональных антител.
Схема реакции агглютинации
,
Слайд 7
Ориентировочная реакция агглютинации
Определение (серотипирование) возбудителя, выделенного от
больного.
На предметном стекле:
капля диагностической агглютинирующей сыворотки (антитела) в
разведении 1:10 или 1:20
+
чистая культура возбудителя, выделенного от больного.
Контроль: вместо сыворотки - каплю раствора натрия хлорида.
При появлении хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации
Слайд 8
Развернутая реакция агглютинации
Определение (серотипирование) возбудителя, выделенного от
больного.
Разведения агглютинирующей сыворотки
+
2—3 капли взвеси возбудителя.
Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости.
Реакция положительная, если агглютинация отмечается в разведении, близком к титру диагностической сыворотки.
Контроли: сыворотка + р-рNaCl - должна быть прозрачной,
взвесь микробов + р-рNaCl - равномерно мутной, без осадка.
Слайд 9
Развернутая реакция агглютинации.
Определение у больного антител.
Разведения
сыворотки крови больного
+
Диагностикум (взвесь убитых микробов)
инкубация при 37 °С
Отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация (осадок).
Характер и скорость агглютинации зависят от вида антигена и антител:
0-диагностикум
(бактерии, убитые нагреванием, => 0-антиген)
- мелкозернистая агглютинация.
Н-диагностикум
(бактерии, убитые формалином, => Н-антиген)
- крупнохлопчатая агглютинация,
протекает быстрее.
Слайд 10
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА)
Определение у
больного антител.
Сыворотка больного
+
Антигенный эритроцитарный диагностикум
(эритроциты с адсорбированными на них антигенами).
Результат: склеивание и выпадение эритроцитов на дно ячейки в виде фестончатого осадка.
Отрицательная реакция: эритроциты оседают в виде «пуговки».
Реакция обратной непрямой гемагглютинации (РОНГА)
Например, обнаружение ботулинического токсина (+эритроцитарный антительный ботулинический диагностикум).
Применение РНГА:
диагностика инфекционных болезней,
определения гонадотропного гормона в моче (беременность),
выявление повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам и др.
Слайд 12
Реакция коагглютинации.
Принцип: стафилококки, содержащие белок А, имеющий
сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, неспецифически адсорбируют антимикробные антитела, которые
затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных.
Стафилококки
+
Иммунная диагностическая
сыворотка (предварительно)
+
Микробы, выделенные от
больных (антигены)
Результ: хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.
Слайд 13
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
Принцип: блокирование антигенов вирусов
антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирусы теряют свойство
агглютинировать эритроциты.
Применение: диагностика многих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещевого энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.
Вирусы
Эритроциты Антивирусные АТ Нейтрализация вирусов
животного
Слайд 14
Реакция агглютинации для определения антирезусных антител
(непрямая
реакция Кумбса)
Обнаружение неполных антител.
Они специфически взаимодействуют с резусположительными
эритроцитами (антигены), но не вызывают их агглютинации.
антирезусные антитела
+
резус-положительные эритроциты
+
антиглобулиновая сыворотка
(антитела против иммуноглобулинов человека)
Результат: агглютинация эритроцитов.
Применение: диагностика патологических состояний, связанных с внутрисосудистым лизисом эритроцитов (ГБН: эритроциты резус-положительного плода соединяются с циркулирующими в крови неполными антителами к резус-фактору, которые перешли через плаценту от резус-отрицательной матери).
Слайд 16
Реакция преципитации (от лат. praecipito - осаждать)
- формирование и осаждение комплекса растворимого молекулярного
антигена с антителами в виде помутнения (преципитата).
Образуется при смешивании АГ и АТ в эквивалентных количествах (избыток одного из них снижает уровень образования иммунного комплекса).
Варианты постановки:
в пробирках,
в гелях,
в питательных средах и др.
Слайд 17
Реакция кольцепреципитации.
Проводят в узких преципитационных пробирках:
на иммунную
сыворотку наслаивают растворимый антиген.
Результат: образуется непрозрачное кольцо преципитата
Реакция Асколи (при сибирской язве)
В качестве антигенов - прокипяченные и профильтрованные водные экстракты органов или тканей.
Слайд 18
Реакция двойной иммунодиффузии
по Оухтерлони.
Постановка:
1. растопленный
агаровый гель тонким слоем выливают на стеклянную пластинку
2.
после затвердевания в геле вырезают лунки (2-3 мм).
3. в лунки раздельно помещают антигены и иммунные сыворотки, которые диффундируют навстречу друг другу.
Результат: в месте встречи образуется преципитат в виде белой полосы. (у идентичных антигенов линии преципитата сливаются; у неидентичных – пересекаются).
Применяется для
обнаружения
дифтерийной палочки.
Слайд 19
Реакция радиальной иммунодиффузии.
Постановка:
1. иммунная
сыворотка + расплавленный агаровый гель равномерно наливают на стекло.
2. после застывания делают лунки
3. в лунки помещают антиген.
Результат: образование кольцевых зон преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца пропорционален концентрации антигена.
Используется для определения содержания в крови иммуноглобулинов различных классов, компонентов системы комплемента и др.
Слайд 20
Реакция радиальной иммунодиффузии
по Манчини
100 50 25 12.5
Слайд 21
Реакция радиальной иммунодиффузии
по Манчини
Слайд 22
Реакции с участием комплемента
- основаны на активации комплемента
комплексом АГ-АТ.
Слайд 23
Реакция связывания комплемента (РСК)
Принцип:
АГ-АТ(Fc-фрагмент) + Комплемент =
связывание
Комплемента.
Постановка в две фазы:
1-я фаза - инкубация смеси антиген + антитело + комплемент;
2-я фаза (индикаторная) - выявление в смеси свободного комплемента; добавляем гемолитическую систему (эритроциты барана + гемолиткческая сыворотка с антителами к ним).
Слайд 24
Оценка результатов:
реакция отрицательная –
свободный
комплемент + комплекс эритроцит - антиэритроцитарное антитело = гемолиз;.
реакция
положительная - связанный комплемент не вызывает гемолиза.
Применение РСК - диагностика инфекционных болезней
(сифилис - реакция Вассермана,
гонококки – реакция Борде-Жанга)
Слайд 25
Реакции иммунного лизиса
Принцип:
АТ-АГ + комплемент = лизис клеток
(активация системы комплемента по классическому пути).
Разновидности:
реакция гемолиза
реакция бактериолиза
Слайд 26
Реакция радиального гемолиза (РРГ)
Постановка:
1. гель из агара
+ эритроциты барана (с адсорбированными антигенами вируса) + комплемент
2.
делаем лунки
3. вносим в лунку сыворотку больного (АТ против вируса)
Результат: вокруг лунки образуется зона гемолиза.
Определяем антитела в сыворотке крови у больных гриппом, краснухой, клещевым энцефалитом.
Слайд 27
Реакция бактериолиза
Принцип: антитела-лизины в присутствии комплемента способны растворять
микробы и другие клеточные элементы.
Постановка: сыворотку б-го разводим бульоном
+
взвесь живых холерных вибрионов
Результат: бульон прозрачный (произошел лизис микробов)
Применяется для диагностики холеры.
Слайд 28
Реакции с использованием меченых
антител или антигенов
Слайд 29
Реакция иммунофлюоресценции
(РИФ)
Основные разновидности метода:
прямой,
непрямой,
с комплементом.
Является методом экспресс-диагностики
для выявления антигенов микробов или определения антител.
Слайд 30
Прямой метод РИФ
Принцип: АГ + АТ
(меченные флюорохромами) = АГ-АТ светится
в УФ-лучах люминесцентного микроскопа.
Результат: бактерии в мазке светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.
Слайд 31
Непрямой метод РИФ
Принцип: выявление АГ-АТ с помощью
антиглобулиновой сыворотки, меченной флюорохромом.
Постановка:
мазок из взвеси микробов
+ диагностическая сыворотка (антитела)
антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают
АГ-АТ + антиглобулиновая (против АТ) сыворотка, меченная флюорохромами
Результат: образуется комплекс АГ-АТ-антиАТ(флюорохром),
который наблюдают в люминесцентном микроскопе.
Преимущества: можно применять разные диагностические сыворотки.
Слайд 33
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
Препарат риккетсий
Слайд 34
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
T.pallidum
Слайд 35
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Принцип: выявление АГ с помощью АТ+фермент-метка
(пероксидаза хрена, бета-галактозидаза или щелочная фосфатаза).
АГ-АТ-фермент + Хромоген
-> изменение цвета продукта реакции
Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
Слайд 36
Иммуноферментный анализ (ИФА)
Применение:
диагностика вирусных, бактериальных и паразитарных болезней
(ВИЧ-инфекций, гепатита В и др.),
определени гормонов, ферментов, лекарственных
препаратов, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях.
Слайд 37
Твердофазный ИФА
Принцип: один из компонентов иммунной
реакции
(антиген или антитела) сорбирован
на твердом носителе
(в лунках планшеток
из полистирола).
Постановка: в лунки планшеток с сорбированным антигеном
+
сыворотка больного
+
антиглобулиновая сыворотка (меченная ферментом)
+
хромоген.
После добавления очередного компонента - тщательная промывка (удаление несвязавшихся реагентов)
Результат: изменение цвета раствора хромогена.
Слайд 38
Конкурентный вариант ИФА
Принцип:
искомый АГ и меченный ферментом
АГ конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества
антител иммунной сыворотки,
искомые АТ и меченые АТ конкурируют друг с другом за антигены.
Интенсивность окраски обратно пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.
Слайд 39
Твердофазный ИФА
(конкурентный и неконкурентный)
Слайд 40
Радиоиммунологический анализ (РИА)
Принцип: применение антигенов или антител, меченных
радионуклидом. Образуется радиоактивный ИК. Его радиоактивность определяют в соответствующем
счетчике (бета- или гамма-излучение).
Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул АГ и АТ.
Модификации:
твердофозный РИА
конкурентный РИА.
Метод представляет определенную экологическую опасность.
Слайд 41
Иммуноблоттинг (от англ. blot, пятно)
сочетание электрофореза и
ИФА или РИА.
Высокочувствительный метод
Принцип. Антиген выделяют с помощью электрофореза
и переносят его на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА.
Постановка: полоски с «блотами» антигенов
+
сыворотка больного
+
антииммуноглобулиновая сыворотка (фермент)
+
хромоген
Результат: изменение
окраски хромогена под
действием фермента
Используется как диагностический
метод при ВИЧ-инфекции и др.
