- Главная
- Разное
- Бизнес и предпринимательство
- Образование
- Развлечения
- Государство
- Спорт
- Графика
- Культурология
- Еда и кулинария
- Лингвистика
- Религиоведение
- Черчение
- Физкультура
- ИЗО
- Психология
- Социология
- Английский язык
- Астрономия
- Алгебра
- Биология
- География
- Геометрия
- Детские презентации
- Информатика
- История
- Литература
- Маркетинг
- Математика
- Медицина
- Менеджмент
- Музыка
- МХК
- Немецкий язык
- ОБЖ
- Обществознание
- Окружающий мир
- Педагогика
- Русский язык
- Технология
- Физика
- Философия
- Химия
- Шаблоны, картинки для презентаций
- Экология
- Экономика
- Юриспруденция
Что такое findslide.org?
FindSlide.org - это сайт презентаций, докладов, шаблонов в формате PowerPoint.
Обратная связь
Email: Нажмите что бы посмотреть
Презентация на тему Основы биотехнологии и биомедицины
Содержание
- 2. Что такое «генная инженерия»?Раздел молекулярной генетики, занимающийся
- 3. «Новые направления в науке гораздо чаще создаются
- 4. В. Гейзенберг: Профессионал это тот, кто знает основные ошибки в своей области и умеет их избегать
- 5. В классической генетике и селекции – отбор
- 6. Программа-максимум генной инженерии – создание жизнеспособного организма
- 7. Крейг Вентер – один из лидеров современной
- 8. Клонирование – одно из ключевых понятий генной инженерии
- 9. Что такое «клонирование»?В генной инженерии: получение «клона»:
- 10. Для чего нужны клоны ДНК?Для удобства проведения исследованийРаботать с индивидуальными молекулами ДНК трудно, но возможно
- 11. Клонирование ДНКЦель – получение клона идентичных
- 12. Выделение нуклеиновых кислотПрежде чем клонировать последовательность, необходимо выделить содержащую ее суммарную ДНК
- 13. Фенольный метод выделения ДНКНейтральные значения pHКислые значения
- 14. Взаимодействие ДНК с поверхностью стеклаГуанидинизотиоцианатСорбция: кислые pH, высокая ионная силаЭлюирование: щелочные pH, низкая ионная сила
- 15. Щелочной метод выделения бактериальных плазмидpH 8,0Фрагменты линейной
- 16. Разделение нуклеиновых кислотЦель: обогащение препаратов нуклеиновых кислот нужными последовательностями
- 17. Аналитический электрофорез молекул ДНК в агарозном или полиакриламидном геле
- 18. Калибровочная кривая для определения размеров фрагментов ДНКkb = т.п.н. =тысячи пар нуклеотидов, mm10 kb1 kb
- 19. СуперскрученнаяКольцевая ковалентно-замкнутаяРелаксированнаяЛинейнаяEcoRIФормы плазмидной ДНКОдно-цепочечный разрыв ДНК
- 20. Электрофоретическая подвижность разных форм плазмиды в присутствии
- 21. Ферменты, используемые в генной инженерииГенные инженеры используют элементы генетических систем, функционирующие в природе
- 22. Эндонуклеазы рестрикции класса II (рестриктазы) – основной
- 23. Номенклатура рестриктаз класса IIHaeI, HaeII, HaeIII –
- 24. Субстратная специфичность рестриктаз класса IIПалиндромные сайты мелкощепящие: BglI
- 25. Изомеры рестриктазИзошизомеры Рестриктазы разных видов бактерий, узнающие
- 26. Формы разрывов ДНК, образующихся под действием рестриктаз класса II«Тупые» концы5’-выступающие3’-выступающие
- 27. Система бактериальной антивирусной защиты CRISPR/Cas CRISPR
- 28. Два способа «затупления» липких концов ДНКЗаполнение ДНК-полимеразойУдаление 3’->5’-экзонуклеазойили S1-нуклеазой
- 29. Механизм действия T4-ДНК-лигазыВосстановление фосфодиэфирной связи между соседними
- 30. ЛинкерыЛигирование по«тупым» концамРасщепление EcoRIЛигирование по «липким» концам,клонированиеСоздание новых сайтов рестрикции на концах клонируемых молекул ДНК
- 31. АдаптерыСоздание новых сайтов рестрикции на концах клонируемых
- 32. Щелочная фосфатаза и полинуклеотидкиназаЩелочная фосфатаза:Оптимальные значения pH
- 33. ДНК-зависимые ДНК-полимеразыДНК-полимераза I (Pol I) (EC 2.7.7.7) Мол.
- 34. Обратные транскриптазы (ОТ)ОТ вируса миелобластоза птиц (AMV
- 35. Три стратегии синтеза первой цепи кДНК обратной транскриптазойСлучайный праймерОлиго(dT)-праймерСпецифический праймер
- 36. SMART-синтез кДНКОлиго-dC присоединяется независимо от матрицы обратной
- 37. Векторы Молекулярно-генетические конструкции, предназначенные для переноса генетического материала
- 38. Свойства, которыми должен обладать любой векторСпособность к
- 39. Плазмидные векторы
- 40. Плазмидный вектор pUC18bla – Ген β-лактамазы, селектируемый
- 41. Плазмидный вектор BluescriptPromegaФагмида (Phagemid)Заражение бактериальных клеток, содержащих
- 42. TA-Клонирование продуктов ПЦРTaq-ДНК-полимераза образует в продукте ПЦР 3’-выступающие A-концы независимо от матрицы
- 43. Структура бактериального гена и его некоторых сильных промоторовterminatorРегуляторная часть генаСтруктурная часть гена
- 44. Регуляция экспрессии генов в векторе pETБактериальнаяклетка BL21DENovagene
- 45. Искусственные хромосомы
- 46. Искусственная хромосома дрожжей YAC (Yeast Artificial Chromosome)>2000
- 47. Бактериальная искусственная хромосома (BAC)CmroriSrepEparAparBparA, parB – контроль
- 48. Емкости векторов разных классов
- 49. Генная инженерия без клонирования – Полимеразная цепная реакция
- 50. Кари Б. Муллис (Kary B. Mullis) –
- 55. Полимеразная цепная реакция: 1-й цикл
- 56. Полимеразная цепная реакция: 2-й цикл
- 57. Изменение температуры в типичном трехступенчатом цикле ПЦР
- 58. Полный температурный профиль полимеразной цепной реакции (25
- 59. ПЦР как молекулярная копировальная машина («молекулярный ксерокс»)После
- 60. Количественная ПЦР ПЦР в реальном времени Real-time
- 61. Устройство капиллярного амплификатора LightCyclerКапилляры объемом 20
- 62. Принцип действия зондов TaqMan5’→3’-экзонуклеаза Taq-ДНК-полимеразы отщепляет флуоресцентный краситель, который начинает флуоресцировать в реакционной смеси ФлуорофорГаситель флуоресценции
- 63. Принцип действия зондов – «молекулярных маяков» (molecular
- 64. Праймеры, меченые флуорофорами, в ПЦР в реальном времениПраймеры «Амплифлюр»Праймеры «Скорпион»
- 65. Мониторинг накопления продуктов ПЦР в реальном времени протекания реакцииСTСT – пороговый цикл
- 66. Калибровочная кривая для определения количества ДНК-матрицы в
- 67. Цифровая ПЦРПозволяет считать отдельные молекулы матричной ДНК в исследуемых образцах
- 68. Новые системы секвенирования ДНК второго и третьего поколений
- 69. Центр по секвенированию ДНК методом СэнгераОдна машина
- 70. Система секвенирования ДНК второго поколения123Фрагментация ДНКЛигирование адаптераПолучение
- 71. Эмульсионная (эм)ПЦР на микрочастицах с иммобилизованным праймеромНачало
- 72. Секвенатор второго поколения фирмы Illumina Производительность –
- 73. Цех секвенаторов 2-го поколения в КитаеФирма BGI-Shenzhen, ноябрь 2011
- 74. Секвенатор третьего поколения PacBio RS фирмы Pacific BiosciencesСистема коммерциализирована и активно продается в течение последнего года
- 75. Схема синтеза ДНК в ZMW-волноводеВозбуждениеЭмиссияМеченые dNTPsВключившийся dNTPОдна
- 76. Процесс секвенирования ДНК на SMRT-чипеВключающийся в ДНК
- 77. Секвенирование через нанопорыУникальная последовательность
- 78. Профиль изменений силы электрического тока во времени при секвенировании через нанопорыВремя
- 79. Секвенатор третьего поколения фирмы Oxford Nanopore
- 80. Скачать презентацию
- 81. Похожие презентации
Что такое «генная инженерия»?Раздел молекулярной генетики, занимающийся разработкой искусственных генетических систем с использованием манипуляций генами на молекулярном уровне путем конструирования рекомбинантных ДНК и РНК
Слайд 3 «Новые направления в науке гораздо чаще создаются с
помощью новых методов, а не новых концепций. Новые концепции
объясняют известные явления по-новому. Новые методы открывают новые явления, которые необходимо объяснить.» Freeman J. DysonСлайд 4 В. Гейзенберг: Профессионал это тот, кто знает основные ошибки
в своей области и умеет их избегать
Слайд 5 В классической генетике и селекции – отбор среди
потомства по определенным признакам ограничен репродуктивной изоляцией
В генной инженерии
при получении трансгенных организмов такие ограничения действуют слабееГенная инженерия облегчает обмен генами между природными генетическими системами
Слайд 6 Программа-максимум генной инженерии – создание жизнеспособного организма de
novo по чертежам, разработанным в лаборатории - «синтетическая биология»
2000
г. - геном вируса гепатита С (9,6 kbp)Слайд 7 Крейг Вентер – один из лидеров современной синтетической
биологии
John Craig Venter, born 1946
Разработал метод идентификации мРНК
с использованием EST-маркеров (expressed sequence tags)1998 Основал фирму Selera (секвенирование генома человека)
2010 Синтетический митохондр. (16.3 kb) геном мыши
2010 Синтетический геном (580-kb ) и синтетический штамм Mycoplasma mycoides
2014 Синтетическая хромосома дрожжей III (273 kb) S. cerevisiae
Разработка и создание биологических модулей,
биологических систем и биологических машин
для решения прикладных задач
Слайд 9
Что такое «клонирование»?
В генной инженерии: получение «клона»: препарата
идентичных молекул ДНК
или
«идентичных» живых организмов
В случае ДНК
два пути решения задачи:Полимеразная цепная реакция (ПЦР)
Рекомбинантные молекулы ДНК
Слайд 10
Для чего нужны клоны ДНК?
Для удобства проведения исследований
Работать
с индивидуальными молекулами ДНК трудно, но возможно
Слайд 11
Клонирование
ДНК
Цель – получение клона идентичных последовательностей
1 –
Объединение вектора со вставкой чужеродной ДНК
2 – Введение рекомбинантного
вектора в клетки3 – Размножение клеток
(получение клона клеток)
или амплификация молекул нуклеиновых кислот - ПЦР
Слайд 12
Выделение нуклеиновых кислот
Прежде чем клонировать последовательность, необходимо выделить
содержащую ее суммарную ДНК
Слайд 13
Фенольный метод выделения ДНК
Нейтральные значения pH
Кислые значения pH
Водная
фаза (ДНК и РНК)
Водная фаза (РНК)
Денатурированные белки
Фенольная фаза
Фенольная фаза
(ДНК)
Слайд 14
Взаимодействие ДНК с поверхностью стекла
Гуанидинизотиоцианат
Сорбция: кислые pH, высокая
ионная сила
Элюирование: щелочные pH, низкая ионная сила
Слайд 15
Щелочной метод выделения бактериальных плазмид
pH 8,0
Фрагменты линейной ДНК
и кольцевая плазмидная ДНК
pH 12,0
Кольца плазмидной ДНК остаются зацепленными
друг за другаpH 8,0
Линейная ДНК агрегирует, кольцевая восстанавливается
Слайд 16
Разделение нуклеиновых кислот
Цель: обогащение препаратов нуклеиновых кислот нужными
последовательностями
Слайд 18
Калибровочная кривая для определения размеров фрагментов ДНК
kb =
т.п.н. =
тысячи пар нуклеотидов
, mm
10 kb
1 kb
Слайд 19
Суперскрученная
Кольцевая ковалентно-
замкнутая
Релаксированная
Линейная
EcoRI
Формы плазмидной ДНК
Одно-
цепочечный
разрыв ДНК
Слайд 20 Электрофоретическая подвижность разных форм плазмиды в присутствии бромистого
этидия
Бромистый этидий
Релакс
Линейная
Супер.
Увеличение отношения EtBr/ДНК
Предел визуальной
чувствительности –
50 нг ДНК/полоса
Слайд 21
Ферменты, используемые в генной инженерии
Генные инженеры используют элементы
генетических систем, функционирующие в природе
Слайд 22 Эндонуклеазы рестрикции класса II (рестриктазы) – основной инструмент
генной инженерии
Узнают специфические последовательности – сайты рестрикции
Активны в виде
димеров в присутствии ионов Mg2+Изучено более 3000 и коммерчески доступно около 600 рестриктаз
Слайд 23
Номенклатура рестриктаз класса II
HaeI, HaeII, HaeIII – Haemophilus
aegipticus, открыты в указанной последовательности
Hinc и Hind – Haemophilus
influenzae, штаммы c и d
Слайд 24
Субстратная специфичность рестриктаз класса II
Палиндромные сайты
мелкощепящие: BglI (GGCC),
крупнощепящие: EcoRI (GAATTC), NotI (GCGGCCGC)
Частично вырожденные сайты
HincII (GTYRAC,
Y = pYrimidine, R = puRine),Разорванные сайты
BglI (GCCN5GGC, N = aNy)
Квазисимметричные сайты
BtrI (CAC↓GTC, класс IIQ)
Двойные сайты:
SfiI (GGCCN5 GGCC)
Разрезание со смещением - класс IIS
(FocI GGATGN9,13 Shifted cleavage) Последовательности липких концов уникальны
Изменение субстратной специфичности в неоптимальных условиях
EcoRI - GAATTC, EcoRI* - AATT (Mg2+ , органические растворители)
Слайд 25
Изомеры рестриктаз
Изошизомеры
Рестриктазы разных видов бактерий, узнающие одинаковые
сайты рестрикции и одинаково их расщепляющие.
Метилчувствительные рестриктазы:
HpaII и
MspI (CCGG) – первый не расщепляет ДНК, если хотя бы один из остатков C метилирован; N-метилирование остатков A – Sau3A (и GATC и GMeATC), DpnI (только GMeATC), MboI (только GATC)
Гетерошизомеры
Узнают одинаковые сайты рестрикции, но по-разному их расщепляют (KpnI - G↓GTACC, Asp7181 - GGTAC↓C)
Изокаудомеры
Узнают разные сайты рестрикции, но создают одинаковые липкие концы. Лигирование с потерей сайта рестрикции
Not I GC*GGCC GC Bsp120 I G*GGCC C BamHI/BclI/BglII/BstYI/DpnII
Слайд 26 Формы разрывов ДНК, образующихся под действием рестриктаз класса
II
«Тупые» концы
5’-выступающие
3’-выступающие
Слайд 27 Система бактериальной антивирусной защиты CRISPR/Cas CRISPR - Clustered
regularly interspaced short palindromic repeats Cas - CRISPR associated proteins
Слайд 28
Два способа «затупления» липких концов ДНК
Заполнение ДНК-полимеразой
Удаление 3’->5’-экзонуклеазой
или
S1-нуклеазой
Слайд 29
Механизм действия T4-ДНК-лигазы
Восстановление фосфодиэфирной связи между соседними остатками
дезоксирибозы на месте одноцепочечного разрыва ДНК
Возможно лигирование фрагментов ДНК
по «тупым» концам
Слайд 30
Линкеры
Лигирование по
«тупым» концам
Расщепление
EcoRI
Лигирование по
«липким» концам,
клонирование
Создание новых
сайтов рестрикции на концах клонируемых молекул ДНК
Слайд 31
Адаптеры
Создание новых сайтов рестрикции на концах клонируемых молекул
ДНК
без использования рестриктаз
Лигирование по
«тупым» концам
(димеризации
адаптеров
не происходит из-за
отсутствия
5’-фосфат-ной группы)
Фосфорилирование
концов вставки
Лигирование по
«липким» концам,
клонирование
Слайд 32
Щелочная фосфатаза и полинуклеотидкиназа
Щелочная фосфатаза:
Оптимальные значения pH -
щелочные
Удаление 5’-фосфатных групп (дефосфорилирование) из ДНК, РНК и нуклеотидов
Фосфатаза
кишечника телят (calf intestinal phosphatase - CIP). ТермолабильнаПолинуклеотидкиназа бактериофага T4:
Перенос γ-фосфатной группы ATP на 5’-OH-группу фрагментов ДНК (фосфорилирование). Введение радиоактивной метки, подготовка к лигированию
Слайд 33
ДНК-зависимые ДНК-полимеразы
ДНК-полимераза I (Pol I) (EC 2.7.7.7)
Мол. масса
109 кДа, Активности: 5’->3’-полимераза, 5’->3’- и 3’->5’- (корректирующая) –экзонуклеазы.
Введение концевой метки в ДНК, ник-трансляция, синтез 2-й цепи кДНК.Фрагмент Кленова: мол. масса 76 кДа (субтилизин), отсутствует 5’->3’-экзонуклеазная активность, введение метки, одноцепочечные зонды.
Термостабильные ДНК-полимеразы
T4-ДНК-полимераза
Мол. масса 114 кДа, отсутствует 5’->3’-экзонуклеаза, введение метки, «шлифовка» концов ДНК 3’->5’- экзонуклеазой.
T7-ДНК-полимераза
«Секвеназа» - искусственно снижена 3’->5’- экзонуклеазная активность, повышены процессивность и скорость синтеза ДНК. «Термосеквеназа» - получена из Taq-ДНК-полимеразы – повышено сродство к ddNTPs, снижена активность 5’->3’-экзо
Слайд 34
Обратные транскриптазы (ОТ)
ОТ вируса миелобластоза птиц (AMV RT)
– димер, хорошо транскрибирует сильно структурированные матрицы
ОТ вируса мышиного
лейкоза Молони (M-MLV RT) – мономер, рекомбинантный ферментOT ВИЧ-1 – транскрибирует как РНК, так и ДНК
Нуждаются в ДНК-затравке (праймере)
Обладают активностью РНКазы H, деградирует РНК-матрицу в процессе синтеза первой цепи
Мутанты рекомбинантной M-MLV RT без РНКазы H более эффективны в синтезе первой цепи кДНК
Высокая частота ошибок – до 5 х 10–3/нуклеотид
Слайд 35
Три стратегии синтеза первой цепи кДНК обратной транскриптазой
Случайный
праймер
Олиго(dT)-праймер
Специфический праймер
Слайд 36
SMART-синтез кДНК
Олиго-dC присоединяется независимо от матрицы обратной транскриптазой
Олиго-dG
с адаптером исходно добавлен в реакционную смесь и используется
ОТ в качестве матрицы для завершения синтеза первой цепи кДНК
Слайд 37
Векторы
Молекулярно-генетические конструкции, предназначенные для переноса генетического материала в
клетки живых организмов
Векторы для клонирования (Cloning vectors)
Экспрессирующие векторы (Expression
vectors)Векторы для слияния генов (Gene fusion vectors)
Бинарные (челночные) векторы (Shuttle vectors)
Слайд 38
Свойства, которыми должен обладать любой вектор
Способность к длительному
существованию в клетках-хозяевах (репликация автономная или в составе хромосом)
Наличие
биохимических или генетических маркеров, которые позволяют обнаруживать его присутствие в клеткахДолжны допускать встраивание чужеродной ДНК без нарушения своей функциональной целостности
Слайд 40
Плазмидный вектор pUC18
bla – Ген β-лактамазы, селектируемый маркер
(устойчивость ампициллину)
ori – Точка начала репликации (origin)
lacZ ‘ –
N-концевая часть гена β-галактозидазы (кодирует146 из 1021 АК- остатков), селектируемый маркер (хромогенный субстрат X-Gal)lacI – Ген Lac-репрессора (Индуктор – IPTG)
Полилинкер
Слайд 41
Плазмидный вектор Bluescript
Promega
Фагмида (Phagemid)
Заражение бактериальных клеток, содержащих фагмиды,
фагом-помощником, приводит к синтезу одноцепочечной ДНК фагмиды и ее
упаковке в фаговые частицы
Слайд 42
TA-Клонирование продуктов ПЦР
Taq-ДНК-полимераза образует в продукте ПЦР 3’-выступающие
A-концы независимо от матрицы
Слайд 43
Структура бактериального гена и его некоторых сильных промоторов
terminator
Регуляторная
часть гена
Структурная часть гена
Слайд 46
Искусственная хромосома дрожжей YAC
(Yeast Artificial Chromosome)
>2000 т.п.н.
ura3 –
ген оротидин-
5’-фосфатдекарбоксилазы
жизненноважный:
позитивный отбор
5-фтороротовая кислота (нетоксична)
5-фторурацил (токсичен)
негативный отбор
5-ФОК
Слайд 47
Бактериальная искусственная хромосома (BAC)
Cmr
oriS
repE
parA
parB
parA, parB – контроль числа
копий (1-2)
Cmr – селектируемый маркер
oriS, repE – односторонняя
репликацияcosN – сайт терминазы λ
loxP – cre-рекомбиназа фага P1
cosN
loxP
Емкость – 300 т.п.н.
Стабилен на протяжении 100 генераций
Слайд 50 Кари Б. Муллис (Kary B. Mullis) – изобретатель
полимеразной цепной реакции (ПЦР)
Американский биохимик 1944 г.р.
Патент - 1985
г., фирма Cetus Corp. California Нобелевская премия по химии – 1993 г.
Слайд 58
Полный температурный профиль полимеразной цепной реакции (25 циклов)
a
– начальная
денатурация
ДНК
b
– собственнореакция
с – достройка
цепей ДНК
d – хранение 4°С
Слайд 59
ПЦР как молекулярная копировальная машина («молекулярный ксерокс»)
После 6
циклов ПЦР образуется 64 идентичных копии исходного генетического локуса
(ампликона)Ни одна реакция в цикле не доходит до конца
Слайд 60 Количественная ПЦР ПЦР в реальном времени Real-time PCR Позволяет, не открывая
пробирки, непрерывно следить за накоплением продуктов ПЦР в пробах
Слайд 61
Устройство капиллярного амплификатора
LightCycler
Капилляры объемом 20 мкл обеспечивают
высокое соотношение поверхности к объему и высокую скорость теплообмена.
30 циклов завершаются за 20-30 мин
Слайд 62
Принцип действия зондов TaqMan
5’→3’-экзонуклеаза Taq-ДНК-полимеразы отщепляет флуоресцентный краситель,
который начинает флуоресцировать в реакционной смеси
Флуорофор
Гаситель флуоресценции
Слайд 63 Принцип действия зондов – «молекулярных маяков» (molecular beacon
probes)
В растворе зонды образуют структуру «стебель-петля», что приводит к
сближению флуорофора и гасителя флуоресценции
Слайд 64
Праймеры, меченые флуорофорами, в ПЦР в реальном времени
Праймеры
«Амплифлюр»
Праймеры «Скорпион»
Слайд 65 Мониторинг накопления продуктов ПЦР в реальном времени протекания
реакции
СT
СT – пороговый цикл
Слайд 66
Калибровочная кривая для определения количества ДНК-матрицы в пробе
Определение
числа плазмидных копий гена F8 в трансфицированных клетках человека
Концентрация
ДНК в крайних точках различается на 9 порядков
Слайд 69
Центр по секвенированию ДНК методом Сэнгера
Одна машина может
анализировать 96 образцов одновременно (96 капилляров),
750 п.н. за один
прогон, 6 прогонов в день,Итого:
одна машина может определять
~345 600 п.н. в один день
Слайд 70
Система секвенирования ДНК второго поколения
1
2
3
Фрагментация ДНК
Лигирование адаптера
Получение полимеразных
колоний фрагментов ДНК
Циклическое секвенирование микроматрицы
Одновременно секвенируются миллионы молекул ДНК
За
один прогон прибора секвенируются более 1 миллиарда нуклеотидов ДНК – 1000-кратное увеличение производительности
Слайд 71
Эмульсионная (эм)ПЦР на микрочастицах с иммобилизованным праймером
Начало 1-го
цикла эмПЦР
Начало 2-го цикла эмПЦР
Начало 3-го цикла эмПЦР
эмПЦР
Матрица оцДНК
Праймеры
Гидрофобная
фазаэмПЦР
Слайд 72
Секвенатор второго поколения фирмы Illumina
Производительность – 600
Gb (6 x 1011 bp) за 11 дней;
Макс.
длина секвенируемого фрагмента – 2 x 100 bp;Секвенирование синтезом, молек. колонии - кластеры на стекле
Слайд 74
Секвенатор третьего поколения PacBio RS фирмы Pacific Biosciences
Система
коммерциализирована и активно продается в течение последнего года
Слайд 75
Схема синтеза ДНК в ZMW-волноводе
Возбуждение
Эмиссия
Меченые dNTPs
Включившийся dNTP
Одна молекула
ДНК-полимеразы иммобилизована на дне каждого волновода
Флуорофор присоединен к γ-фосфатной
группе нуклеотида-субстрата
Слайд 76
Процесс секвенирования ДНК на SMRT-чипе
Включающийся в ДНК меченый
нуклеотид задерживается в объеме считывания флуоресценции в течение миллисекунд,
свободно диффундирующий нуклеотид – в течение наносекунд.Включение обнаруживается в виде вспышки света определенной длины волны, характерной для конкретного нуклеотида..
Слайд 77
Секвенирование через нанопоры
Уникальная последовательность
Гомополимер
Часть мембраны с нанопорой,
через которую проходит одноцепочечная ДНКИзменения силы тока, проходящего через мембрану, под действием отдельных нуклеотидов ДНК
Слайд 78 Профиль изменений силы электрического тока во времени при
секвенировании через нанопоры
Время
Слайд 79 Секвенатор третьего поколения фирмы Oxford Nanopore Technologies (2014
г)
Производительность 1 млрд нуклеотидов за 6 часов. Ср. длина
считывания: 5,4 kb. Десятки тысяч нуклеотидов/1 прогон
Компьютер – ноутбук с USB-разъемом
Стоимость ~$900
Дэвид Димер (David Deamer) -
Предложил принцип метода секвенирования через нанопоры в 1989 году
2014 – секвенирован бактериальный геном
A good first shot, but not a game-changer — yet!
