Презентация на тему Электрофоретическая подвижность ДНК в гелях

на основе их размера, электрического заряда и других физических

свойств.
«электро» + «форез» (греч. Phoros - «переносить»)
метод, в котором молекулы вынуждены перемещаться через пространство геля под воздействием электрического тока

присутствуют химические группы, обладающие в водном растворе электрическим зарядом.

Величина общего заряда молекулы определятся количеством заряженных групп, их природой, а также pH раствора.
в нуклеиновых кислотах в широком диапазоне pH на каждую фосфатную группу приходится заряд -1.
Под действием внешнего электрического поля заряженные молекулы могут перемещаться к катоду или аноду, в зависимости от их суммарного заряда.

Именно различия в электрофоретической подвижности различных биологических молекул

часто используются для разделения их смесей.

где
U – электрофоретическая подвижность ;
d – расстояние (см), пройденное образцом в геле;
E – напряжённость электрического поля (В/см) в межэлектродном пространстве;
t – время миграции (сек).

d/t

E

гели

геля идёт путём связывания в пространственную сетку пучков нитей,

за счёт образования водородных связей между ними.
Агарозные гели имеют «поры» большого размера и используются для разделения больших молекул
(>200 кДа).
Разделение происходит быстро, но с ограниченным разрешением, т.к. полосы имеют тенденцию размываться (результат большого размера пор).
Агарозные гели менее, чем полиакриламидные среды, чувствительны к случайным флуктуациям в макроструктуре молекул ДНК.

Агаробиоза
(галактоза + 3,6–ангидрогалактоза)

нуклеотидов, отличающиеся даже на один нуклеотид (секвенирование)

Акриламид

частиц используют смешанные гели, состоящие из агарозы (ок. 0.5%)

и полиакриламида (1.5% - 2.5%)
Агароза выполняет лишь функцию механического каркаса, который не нарушает эффект молекулярного сита, создаваемого сеткой ПААГ.
Для образования такой структуры надо обеспечить условия, при которых агароза затвердевает раньше, чем полимеризуется ПААГ.  

Размер молекул ДНК
Концентрация агарозы
Конформация ДНК
Напряженность

электрического поля
Состав оснований и температура
Концентрация ДНК в пробе
Характер растворителя

геле со скоростями, обратно пропорциональными десятичному логарифму их молекулярных

масс, а следовательно, и размеру.
НО: молекулы ДНК должны достаточно свободно мигрировать в геле, лишь изредка сталкиваясь с его волокнами.

электрофоретической подвижности (U) и концентрацией геля (Т):
logU =logU0

–KRT, где
U0 – электрофоретическая подвижность частицы в отсутствие геля;
KR – коэффициент ретардации, зависящий от свойств геля, а также размеров и формы молекулы.
В горизонтальных гелях агароза обычно используется в концентрации от 0.7% до 3%

молекул ДНК

в геле
Изменение эффективного радиуса пор в зависимости от

концентрации агарового геля. ○ радиусы, рассчитанные на основании опытов с гемоглобином, а = 3.08 нм; ● радиусы, рассчитанные на основании опытов с вирусом южной мозаики фасоли, а = 14.0 нм.  

ухудшению разделения, или даже к тому, что крупные молекулы

ДНК совсем не смогут войти в поры геля.

Разделение одной пробы в агарозном геле различной концентрации (0.7 %, 1.0 % и 1.5%). С ростом концентрации геля разделение более длинных фрагментов ДНК ухудшается

одноцепочечным разрывом (форма II)
линейная (форма III),
Разная электрофоретическая

подвижность
линейная форма (форма III) мигрирует медленнее всех

фрагментов линейной ДНК пропорциональна приложенному напряжению.
НО: увеличение напряженности

поля приводит к тому, что более длинные молекулы начинают догонять более короткие ухудшение разделения .
Opt: 5 В/см.
При 10 в/см :
полная остановка больших молекул ДНК.

Напряжённость электрического поля 5 в/см

электрического поля 10 в/см

при 4 – 30оС изменения относительной электрофоретической подвижности ДНК

не наблюдается.
Обычно электрофорез в агарозных гелях ведут при комнатной температуре.
НО: гели, содержащие менее 0,5% агарозы, очень мягкие, поэтому с ними работают при 4оС (они становятся более плотными).

количество ДНК 
бόльшая электрофоретическая подвижность
искажается (размывается) форма

полосы, а после окрашивания интенсивность её свечения перестаёт напрямую соответствовать количеству окрашенной ДНК.
2-500 нг в полосе шириной 0.5 см

и ослабляет действие на неё электрического поля.
само облако

противоионов, обладая противоположным по отношению к молекуле зарядом, будет взаимодействовать с электрическим полем и смещаться в противоположную сторону, тормозя движение молекулы (явление электрофоретического трения).
при движении молекулы отдельные ионы вокруг неё тоже непрерывно перемещаются  в ионной атмосфере происходит непрерывное замещение ионов. Для вновь входящих ионов требуется время, чтобы найти своё место в поле макромолекулы и прийти в равновесие с её окружением, что приводит к нарушению сферически симметричной формы ионной атмосферы. В результате, двойной электрический слой позади частицы растягивается и тормозит её движение (явление релаксационного эффекта)

дорожке геля движутся быстрее или медленнее, чем идентичные фрагменты

в соседней дорожке.
Причины:
  — неодинаковое количество ДНК в разных дорожках;   — неодинаковые ионные условия в препаратах, внесенных в разные дорожки (присутствие примесей, влияющих электрофоретическую подвижность ДНК — солей, спирта, фенола, этидиумбромида и др.);   — избыточная напряженность электрического поля;   — перегрев и нарушение структуры геля (избыточный ток);   — истощение электрофорезного буфера;   — микрогетерогенность геля.
—локальные искривления молекул ДНК (А 3-6 п.н., повторяющиеся каждые 10-11 пар; ПААГ)

В некоторых случаях сдвиг полос носит не ступенчатый, а сглаженный характер (эффект "улыбки").
искажения электрофоретической картины поддаются математическому анализу (маркер в каждую 3-4 дорожку).

обычной линейкой (малая точность, неприменим для коротких гелей)
Дигитайзер (графический

планшет) (анг. — digitizer), представляющий собой электронный модуль, включающий курсор-измеритель и цифровое координатное устройство.
компьютеризованные регистрирующие системы, снабженные соответствующими программными средствами.