Презентация на тему ИФА – иммуноферментный анализ

качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и

пр., в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

типу проводимых на каждой из
иммунохимических стадий реакций
Гомогенно-гетерогенные

анализа
конкурентный
неконкурентный
прямой
непрямой

в виде стандартно штампованных микроплашек с 96 или 60

лунками (или шарики, колпачки и прочее - для постановки единичных проб);

Белки хорошо сорбируются на подобранных для ИФА пластмассовых материалах.
Все остальные реагенты тест-систем используют в виде растворов.
Результат реакции «остается» на твердой фазе и регистрируется количественно.

ИФА, основанный на связи с ферментами.

В основе гомогенного

ИФА лежит ингибирование активности фермента при его соединении с антигеном и восстановление ее в результате реакции антиген – антитело или же, наоборот, потеря активности фермента в результате реакции.
Существенным достоинством гомогенного ИФА является экспрессность определения, которая составляет 2 – 5 минут.
К недостаткам следует отнести меньшую чувствительность, чем в гетерогенном ИФА (~ 1 мкг/мл).

E

+

E

содержащий определяемое вещество и фиксированную концентрацию меченого антигена, инкубируют

и после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов.
Величина детектируемого сигнала находится в обратной зависимости от концентрации антигена.

Принцип - иммобилизованые на твердой фазе специфические антитела + меченый ферментом и немеченый антиген конкуриру-ют за связь с антителом.

ХОД РЕАКЦИИ

добавляют раствор, содержащий анализируемый антиген. В процессе инкубации образуется

комплекс антиген-антитело.
Добавляют меченные ферментом специфические антитела.
Ферментативная  реакция –при добавлении субстрата
Определяют ферментативную активность носителя, которая пропорциональна начальной концентрации исследуемого антигена.

оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных

антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод.
метод может быть использован для анализа только тех антигенов, на поверхности которых существуют, Сэндвич по крайней мере, две антигенные детерминанты.

и не к антителу против целевого антигена, а к

так называемым вторым антителам - антивидовым антииммуноглобулиновым антителам, т.е. антителам к иммуноглобулинам того вида животных или человека, с биологическим материалом которого работают.

антигенов или антител
Вместо антивидовых антиглобулиновых антител для конъюгации с

ферментом может быть использован, например, протеин А стафилококка, который по своей природе с высокой аффинностью связывается с иммуноглобулинами класса G некоторых видов млекопитающих, включая человека.

антитела и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель.
ХОД РЕАКЦИИ



На

поверхности носителя иммобилизуют антиген-белок
добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют.
добавляют фиксированную концентрацию меченых антивидовых антител (вторичных).
детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов,
причем величина сигнала находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена

методов синтеза ферментных конъюгатов,
а также возможное влияние компонентов

образца на активность фермента.

Даёт возможность выявлять антитела
к разным антигенам.
Анализируемый образец и
меченый реагент вводятся в систему
на разных стадиях,
что устраняет влияние различных эффекторов,

Применение универсального реагента 
— меченых антивидовых антител усложняет
анализ проведение из-за введения
дополнительных стадий.

ПРЯМОЙ ИФА

НЕПРЯМОЙ ИФА

Преимущества и недостатки

преимущество

недостатки

• орто-фенилендиамин (продукт желто-коричневый, растворимый, поглощает при 492 нм);•

 3,3'-диаминобензидин (продукт коричневый, нерастворимый); •  3-амино-9-этилкарбазол (продукт красный; нерастворимый); •  
β-Галактозидаза (субстраты - дериваты β-галактозида, например 4-метилумбелиферил-β-D-галактозин).
Щелочная фосфатаза (субстраты: 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат в комбинации с голубым тетразолиевым, продукт голубой, нерастворимый; р-нитрофенил фосфат, продукт желтый, растворимый, поглощает при 405 нм).
Уреаза (субстрат - мочевина в комбинации с бромкрезолом пурпурным, продукт образуется очень быстро, пурпурного цвета, растворимый, поглощает при 590 нм).

заданный антиген или интересующее антитело не удается конъюгировать с

меткой без существенных потерь в аффинности их связывания, то в конструкцию тест-системы пробуют вводить дополнительные компоненты.
Авидин - белок, выделяемый из «белка» куриных яиц, биотин - витамин Н (он же кофермент R). Авидин по своей природе с высокой аффинностью (Kd ~ 10-15 M) связывает биотин.
Биотин легко конъюгируется с флюоресцеином. Кроме того, и против авидина, и против биотина получены высокоаффинные моноклональные антитела.
Сходным по аффинности сродством к биотину обладает также белок стрептавидин, выделяемый из грибов Streptomyces avidinii.

и чувствительность метода ИФА (более 90%). 2) Возможность определения заболевания

и отслеживания динамики процесса, то есть сравнивание количества антител в разных временных промежутках. 3) Доступность ИФА-диагностики в любом медицинском учреждении.

Относительный недостаток:
Выявление иммунного ответа (антител), но не самого возбудителя.

Оборудование: ИФА-ридер, шейкер, промыватель

в тестируемых образцах модификаторов активности ферментов (кофакторов, ингибиторов);
возможность

денатурации ферментов под действием внешних факторов;
применение метода возможно лишь к хорошо изученным системам, где есть очищенные антигены и высокоспецифичные антитела.

ИФА используют в сочетании с соответствующими хроматографическими подтверждающими методами.
ВЕСТЕРН

БЛОТТИНГ – подтверждающий метод для диагностики ВИЧ